Центр Коллективного Пользования ::: <b><font color=red>NEW</font></b> Порядок Работы :: Требования к образцу

21.02.2011

Переименование ЦКП

центр коллективного пользования "Центр постгеномных технологий" переименован в ЦКП "Протеом человека"


03.03.2010

Новые услуги

Обновлен перечень услуг ЦКП

также изменены цены на отдельные услуги

смотрите раздел порядок работы - услуги и цены


02.06.2006

Форум

Появился форум


02.06.2006

Новая версия сайта

2 июня 2006 Начало работы новой версии сайта ЦКП Центр постгеномных технологий


Требования к образцу

Выбор метода анализа




  • Качество спектров MALDI в большой степени зависит от качества полученного кристалла – сокристаллизованного с матрицей образца. Процесс регистрации спектра достаточно быстрый, при этом точность измерения массы может быть до 5 ppm для пептидов с молекулярной массой менее 2500 Да. Чем больше молекула – тем меньше точность измерения.
    MALDI масс-спектрометрия является оптимальным методом для пептидного картирования белков, анализа пептидов массой более 500 Да и наиболее приемлемым методом анализа тяжелых белков, массой вплоть до 300-400 кДа и нуклеиновых кислот до 100 пар оснований.
    MALDI также позволяет регистрировать спектры в диапазоне масс менее 500 дальтон. Однако в этом случае сигнал исследуемого иона регистрируется на фоне множества артефактных ионов матрицы, при этом добиться хорошего качества сигнала исследуемого иона удается не всегда.
    В целом, можно сказать, что для анализа маленьких молекул предпочтительными являются приборы с электроспрейным методом ионизации.


    Количество образца



  • Как правило, для анализа достаточно 1 пикомоля пептида; 1-10 пикомолей белка и 10-100 пикомолей ДНК. Для анализа мы используем 0,5 мкл образца, смешивая его с эквивалентным объемом раствора матрицы. В случае необходимости образец может быть сконцентрирован на центрифужном испарителе.


    Требования к чистоте образца



  • Образцы должны быть свободны от солей и детергентов, так как и те и другие значительно подавляют ионизацию. Мы можем обессолить образцы пептидов с использованием ZipTip C18. Если же речь идет о белках или о необходимости удаления из образца детергентов, то в этом случае выбор метода очистки зависит от свойств Вашего образца, поэтому необходимую подготовку Вы должны провести самостоятельно.

  • Несомненно, что полностью избавиться от солей и детергентов удается не всегда и не всегда это просто сделать. Как правило, ориентироваться можно на молярность буфера порядка 10 мМ.

  • Учитывая весьма невысокую стоимость анализа, можно попробовать сделать серию разведений образца, и выбрать условия минимального влияния солей и детергентов на эффективность ионизации, а очистку образца проводить лишь в случае неудовлетворительного качества полученных таким образом спектров.
    (Учтите, что для анализа необходимо около 1-10 пм образца в 1 мкл)


    Идентификация белка в геле



  • Мы не проводили работ по измерению количества белка в геле (имеется в виду количество белка в отдельном пятне, а не внесенный в гель белок), но основываясь на литературных данных это порядка 200 фмоль на пятно для гелей окрашенных Кумасси. Чувствительность окраски серебром, как правило, выше, при этом зависит от многих параметров.

  • Впрочем, задача, скорее всего, состоит в идентификации белка, и требования было бы проще сформулировать так:
    При окраске Кумасси, в видимом невооруженным глазом пятне достаточно белка для его идентификации.
    Возможные сложности связаны с качеством разделения белков – с использованием MALDI-MS практически невозможно идентифицировать белок, если в пятне больше одного-двух различных белков. Очевидно, 2D-PAGE предпочтителен.
    Не всегда возможно идентифицировать белок массой меньше 15-20 кДа и больше 100-130 кДа
    Для окрашенных серебром гелей подобного правила нет. Необходимо отметить одно требование и одно пожелание:
    Если предполагается проведение идентификации белков – при окраске серебром нельзя применять методы, использующие глютаровый альдегид
  • Гели очень желательно прокрашивать до минимально необходимой для визуализации белка степени.



    Супрессия ионообразования



  • Интенсивность сигнала образца пептида в растворе 0,1% детергента в 50:50 ацетонитрил:вода по отношению к сигналу в растворе без детергента для различных детергентов составляет:

    sodium dodecylsulfate (SDS) < 10%
    sodium taurocholate < 10%
    sodium cholate 21-30%
    LDAO < 10%
    CTAB < 10%
    CHAPS 31-60%
    Tween 20 10-20%
    Thesit < 10%
    Triton X-100 < 10%
    NP40 < 10%
    n-octyl sucrose 10-20%
    n-dodecyl sucrose 10-20%
    n-dodecyl maltoside 21-30%
    octyl glucoside 21-30%
    octyl thioglucoside 21-30%
    n-hexyl glucoside 30-60%
    n-dodecyl glucoside > 60%